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PCR反应没有目的片段考虑方面
日期：2025-04-30 16:25
浏览次数：222
摘要：PCR反应没有目的片段考虑方面:
1. 含有PCR反应抑制物
对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在；
2. 模板浓度太低，扩增循环数不够
尽可能降低退火温度，在降落PCR 的低温度增加10个扩增循环；
3. 非特异扩增
增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR
4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对
改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH
5. 原始模板浓度太低
使用巢式引物...
PCR反应没有目的片段考虑方面:
1. 含有PCR反应抑制物
对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在；
2. 模板浓度太低，扩增循环数不够
尽可能降低退火温度，在降落PCR 的低温度增加10个扩增循环；
3. 非特异扩增
增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR
4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对
改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH
5. 原始模板浓度太低
使用巢式引物对第1次扩增产物进行稀释（l :100 和1:1000)后扩增；
6. 扩增需要增强剂
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亚枫CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增强剂
7. 引物设计存在问题
重新设计引物
1. 含有PCR反应抑制物
对样本稀释(l: 100 和1:1000) 后再扩增，并通过在已知阳性模板中加入原始PCR 混合物进行扩增，验证抑制物的存在；
2. 模板浓度太低，扩增循环数不够
尽可能降低退火温度，在降落PCR 的低温度增加10个扩增循环；
3. 非特异扩增
增加起始模板的变性温度(通常为95℃ 5min)，采用降落PCR和热启动PCR
4. 扩增反应混合液中各成分浓度不对
改变TaqDNA 聚合酶、dNTPs 、引物、Mg 2+ 等的浓度及缓冲液的pH
5. 原始模板浓度太低
使用巢式引物对第1次扩增产物进行稀释（l :100 和1:1000)后扩增；
6. 扩增需要增强剂
加入BSA(10 ~ 100μg/ ml) 、二甲基亚枫CDMSO) 0 % ~10 %) 、甘油(5 % ~20 % )等一些增强剂
7. 引物设计存在问题
重新设计引物